细胞学堂 | 贴壁细胞6大培养难题原因和解决方法

更新时间：2023-03-24 | 点击率：989

贴壁细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。

贴壁细胞因其培养过程较为繁琐，所以培养时更容易出现问题。以下总结了贴壁细胞培养中常见的6种问题，并详细介绍原因和解决方法，若培养时遇到这些情况，可参考对应解决方法处理。

传代后细胞全部飘起

解决方法：检查所使用的培养基的颜色是否偏紫色（如图1），检查瓶盖是否透气，不透气瓶盖是否被拧松。

图1. 培养基颜色偏紫

通常培养基偏碱，颜色就会偏紫，主要是因为培养基里的酚红指示剂遇酸变黄、遇碱变紫，培养基量太少，或培养基存放时间太长时都会变碱。建议配好完-全培养基后分装到50mL离心管并于一周内用完，量少时放到15mL离心管里保存。

传代后部分细胞漂浮

原因及解决方法如下

传代前细胞密度太大：一般细胞汇合度达到80%时可进行传代操作，传代密度需适中，传代密度过高也会导致传代后漂浮；

细胞状态不好：可通过提高血清比例、稳定培养环境等方法进行改善；

吹打次数过多造成机械损伤：轻柔吹打，细胞呈单颗粒时可停止吹打，吹打过程避免气泡产生；

培养基更换后不适应：更换回原来的培养基；或者与原培养基比例混合后使用，使细胞有个适应期。

传代后细胞变形

原因及解决方法如下

1）变形，但细胞还在生长：可能是血清批次不一样导致，血清成分复杂，不同批次和品牌间均存在成分差异，影响细胞状态。建议使用同一批次血清，更换血清时需与原血清比例混合后使用，使细胞有过渡期；

2）变形，但细胞不长，且碎片增多：可能传代操作过程损伤，常见于消化不当，或者潜在支原体等污染导致细胞病态；消化时间根据每个细胞的状态来调整，消化过度或者消化不充分均会对细胞造成影响；培养过程应严格无菌操作，实验环境尽量洁净，确保细胞无外源污染。

细胞生长周期变慢，边养边漂

原因及解决方法如下

细胞传代时密度太稀或太密：建议细胞密度达80%左右进行传代，传代密度适中，密度过低会延长生长周期；

传代操作不当：根据细胞特性决定细胞消化时间，一般在显微镜下观察细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可终止消化，难消化的细胞可分次消化，每次时间不超过5min；频繁换液或者清洗细胞也会导致细胞状态变差，常规换液时间间隔为2~3天。

传代后细胞成团

解决方法如下

低密度接种，延长换液时间，防止细胞脱落；

使用多聚赖氨酸包被培养器皿，以增加细胞贴壁牢固度，降低细胞聚集成团的几率；

重新铺板，并更换新配制的培养基，加大血清比例（增加比例不超过5%）；

接种时，减少培养基量（如T25加3mL）以加快细胞贴壁速度，等待细胞贴壁后（约8-12小时），再补加培养基到正常用量。

细胞出现空泡

原因及解决方法如下

1）正常的细胞活动：有的细胞有正常的自噬行为或其他膜泡活动，无需特殊处理（如Caco-2细胞）；

2）血清不适应、培养基成分改变、换液不及时等造成细胞营养不良：可通过更换更合适的血清或及时换液等方法解决；

3）机械损伤、PH偏高或偏低等造成细胞受损：注意培养条件及操作手法。