细胞培养中常见细胞污染类型及预防办法

凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染，细胞污染不能*被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。

本文将简要介绍几种常见的细胞污染类型及处理方法。

常见污染类型

细菌污染

特征：大小在0.5~5 μm，比动物细胞小很多。多呈球状或杆状，形态规则，分布均匀；增殖速度快，一般污染后48~72小时爆发式增殖；营养消耗快，培养基很快变黄，变浑浊；镜下观察有明显的定向运动。

处理方法：轻度污染可用10X双抗清洗处理，重度污染建议消杀后丢弃。

真菌污染

特征：呈链球状或丝状。常形成肉眼可见的菌落，培养基颜色无变化或变紫，仅对局部细胞影响较大，其他地方生长正常。会形成孢子，容易污染其他细胞。

处理方法：真菌污染较难根-除，不建议保留，建议消杀后丢弃。

支原体污染

特征：最小的微生物，无法通过光学显微镜看见，但可通过电镜观察到。感染支原体的细胞，在某一时间点碎片突然增多，随着传代，细胞状态显著变差。支原体污染可通过气溶胶传播，影响同一细胞房其他细胞。

鉴定方法：PCR法、显色法、荧光染色法等。

处理方法：若细胞状态尚可，添加支原体抑制剂培养2-3代可转阴；若细胞状态很差，建议消杀后丢弃。

黑胶虫污染

特征：无明确定义，镜下无法直接观察到。主要表现为细胞状态差，黑点和碎片多，布朗运动。通过检测发现主要为支原体污染，部分为未知的增殖不明显的微生物污染。

处理方式：若细胞状态尚可，添加黑胶虫/支原体抑制剂培养2-3代可转阴；若细胞状态很差，建议消杀后丢弃。

细胞交叉污染

特征：即不同的细胞混杂在一起

鉴定方法：

同种属：STR鉴定，多等位基因数大于3个。
（需考虑本身的遗传背景，如EA.hy 926为融合细胞，本身就包含两套遗传信息）

不同种属：PCR法，对种属特异性基因进行扩增，不同种属产物大小不同。

处理方法：建议重新引种。

细胞污染后的处置

细胞一旦发现有污染出现，应及时对所用试剂和耗材进行清理。耗材可更换新的或者重新高压灭菌，试剂可重新过滤除菌或者更换新批次，操作台和细胞房需用消毒液进行全面清洁消杀后方可复苏新的细胞，以免反复出现污染。

污染防治策略

1 细胞房环境控制

环境要求：

洁净区10000级，局部100级，定期进行沉降菌检测

环境消毒：每周一次定期消毒灭菌

1） 地面/墙面：84消毒液、新洁尔灭交叉使用

2） 环境消毒：定期紫外照射，臭氧熏蒸

3） 仪器设备表面：75%酒精擦拭

2 实验人员管理

着装：着连体衣，戴口罩、手套，头发、手腕等要包好，减少皮肤外露。

行为：减少走动，出入关门，操作时不要讲话。

技能：养成良好的无菌操作习惯。

其他：减少共用物品，公共使用区域统一使用习惯，区分洁净区域和有风险的区域。

3 实验用品管理

试剂：使用前确保无菌，自己配制的试剂需过滤除菌后再使用。

耗材：需要重复使用的耗材确保按照规定清洗、高温高压灭菌，使用灭菌指示带。灭菌后烘干的耗材立刻放进超净台，一周内使用完毕，未使用完的，需重新灭菌再使用。

仪器设备：定期擦拭消毒，培养箱、显微镜托盘等高风险区域需经常清洁，培养箱水盘和复苏用的水浴锅需添加抑菌剂。

其他：当出现培养物泄漏时，应及时清理干净；出现局部污染时，应找出污染源并对环境整体消毒。